奥希替尼(osimertinib)联合蟾毒灵显著抑制了细胞的生存能力-

南亚先生
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2021年3月23日14:00:53奥希替尼(osimertinib)联合蟾毒灵显著抑制了细胞的生存能力-已关闭评论
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令人惊讶的是,奥希替尼联合蟾毒灵显著抑制了细胞的生存能力,每个药品浓度的联合医治CI

  蟾毒灵增强了奥希替尼(osimertinib)诱导的对奥希替尼(osimertinib)耐受药物的NSCLC细胞存活率的减少

  PC-9和HCC827细胞对奥希替尼(osimertinib)表现出较高的敏感性。然而,即使在高浓度的1 μM,奥希替尼(osimertinib)仅略有降低的可行性中冲/或HCC827和/或细胞。接下来,我们研究蟾毒灵是否能增强奥希替尼(osimertinib)诱导的耐受药物NSCLC细胞存活率下降。蟾毒灵以剂量依赖的方法减少了对奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞的细胞存活率。

  令人惊讶的是,奥希替尼(osimertinib)联合蟾毒灵显著抑制了细胞的生存能力,每个药品浓度的联合医治CI<0.6。因此,蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)在减少细胞活力方面具有较强的协同效应。长期实验结果也显示,奥希替尼(osimertinib)与蟾毒灵联用明显抑制了对奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞的定植形成能力。这些结果证实蟾毒灵有效克服了对奥希替尼(osimertinib)的耐受药物。

  蟾毒灵增强奥希替尼(osimertinib)诱导的对奥希替尼(osimertinib)耐受药物的NSCLC细胞凋亡

  调查是否奥希替尼(osimertinib)引发细胞凋亡,中冲,中冲/或HCC827,HCC827/或细胞暴露在奥希替尼(osimertinib)24 h。采用AnnexinV/7-AAD和westernblotting检查细胞凋亡。我们观察到,在PC-9和HCC827细胞中,奥希替尼(osimertinib)诱导细胞强劲凋亡,并延长了裂解的PARP和caspase-3的水平,但对奥希替尼(o
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simertinib)耐受药物细胞的作用不大或没有影响。这些发现与之前的研究结果一致,即奥希替尼(osimertinib)失去了诱导耐受药物NSCLC细胞凋亡的能力。接下来,我们确定蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)的联合使用药是否会诱导对奥希替尼(osimertinib)耐受药物的NSCLC细胞凋亡。奥希替尼(osimertinib)未能在中冲/或诱导细胞凋亡和HCC827/或细胞。有趣的是,与单独使用两种药品相比,蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)联用显著触发细胞凋亡,并上调了裂解caspase-3和PARP的表达。这些发现进一步证实蟾毒灵有能力克服对奥希替尼(osimertinib)的耐受药物性。

  奥希替尼(osimertinib)联合蟾毒灵能有效抑制对奥希替尼(osimertinib)耐受药物的非小细胞肺癌异种移植瘤的生长

  为了进一步阐明蟾毒灵是否能在体内恢复对奥希替尼(osimertinib)耐受药物的NSCLC细胞对奥希替尼(osimertinib)的敏感性,将PC-9/或细胞注射到裸鼠体内可产生异种移植瘤。体外结果显示,单独使用奥希替尼(osimertinib)不能抑制PC-9/或肿瘤的生长,而蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)联用能够显著抑制这些异种移植物的生长,且不会导致显著的体重减轻。采用TUNEL染色法分析蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)诱导的细胞去世。与对照剂、蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)单独使用相比,蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)联用显著延长了细胞去世。免疫组化分析也显示,与单独使用蟾毒灵和蟾毒灵相比,奥希替尼(osimertinib)和蟾毒灵联用时,caspase-3的裂解明显延长。这些结果表明蟾毒灵可以通过诱导细胞凋亡来消除体内对奥希替尼(osimertinib)的获得性抗性。

  蟾毒灵通过下调MCL-1恢复奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞对奥希替尼(osimertinib)的敏感性

  越来越多的证据表明,过表达mcl1能够保护egfr突变的NSCLC细胞免受奥希替尼(osimertinib)诱导的凋亡。为了验证这一假设,我们首先进行了直接测序,以确定奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞中EGFR突变位点。EGFRexon20和exon21C797S突变及C797S区域的其他突变未在奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞中检查到,提示除了EGFR基因改变外,还有其他机制介导了对奥希替尼(osimertinib)的耐受药物。接下来,在本研究中,我们确定奥希替尼(osimertinib)是否会影响mcl1的表达。如图4A所示,奥希替尼(osimertinib)减少了PC-9和HCC827细胞中MCL-1的水平。然而,这些调节并没有在奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞中观察到,因此支持了之前的研究结果,即上调mcl1可减少奥希替尼(osimertinib)对egfr突变的NSCLC细胞的致病性。

  接下来,我们研究蟾毒灵是否通过下调MCL-1延长了奥希替尼(osimertinib)的致命率。我们发现蟾毒灵比奥希替尼(osimertinib)更能减少耐奥希替尼(osimertinib)细胞中mcll-1的表达。为了进一步验证这一结果,PC-9/OR细胞被迫过表达mcll-1。我们观察到,过表达mcl1能够消除蟾毒灵诱导的细胞凋亡。然而,siRNA敲除mcl1促进蟾毒灵诱导的细胞凋亡。总之,这些数据表明蟾毒灵至少部分地通过减少mcl1的水平克服了对奥希替尼(osimertinib)的抗性。

  MEK/ERK/MCL-1通路不参与蟾毒灵介导的对奥希替尼(osimertinib)耐受药物NSCLC细胞中MCL-1的减少

  在最近的一项研究中,我们发现蟾毒灵至少部分通过蛋白酶体降解诱导了mcl1的降低。在本研究中,我们发现蛋白酶体抑制剂MG132抑制了这些抗性细胞系中MCL-1的降解,挽救了蟾毒灵调控的MCL-1抑制。此外,在奥希替尼(osimertinib)或蟾毒灵处置的PC-9/OR和HCC827/OR细胞中,MCL-1的mRNA表达略有延长。与对照组相比,蟾毒灵处置导致PC-9/或细胞中更多的mcll-1泛素化。这些数据表明蟾毒灵通过降解MCL-1逆转了对奥希替尼(osimertinib)的抗性。

  如之前报道的,MEK/erk依赖的mcl1降解调节了egfr突变的NSCLC细胞对奥希替尼(osimertinib)的抗性。因此,我们测试蟾毒灵是否通过抑制MEK/ERK/mcl1通路克服对奥希替尼(osimertinib)的抗性。奥希替尼(osimertinib)没有减少PC-9/OR和HCC827/OR细胞中p-ERK、p-mcl1(Thr163)和mcl1的水平,提示MEK/ERK/mcl1讯号给予奥希替尼(osimertinib)抗性。在相同的条件下,我们注意到蟾毒灵并没有减少奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞中磷酸化的ERK和mcl1的水平。这些结果表明蟾毒灵诱导的MCL-1的下调并不是通过ERK讯号发生的。

  ku70介导的mcl1过表达诱导egfr突变的NSCLC细胞获得奥希替尼(osimertinib)耐受药物

  MCL-1过表达也受到去泛素酶的调控。USP9X和Ku70已被鉴定为MCL-1去泛素酶,可从MCL-1蛋白上去除多聚泛素链,提高MCL-1的稳定性。因此,我们确定了USP9X-和ku70介导的mcl1过表达是不是egfr突变的NSCLC细胞中奥希替尼(osimertinib)耐受药物的其他关键机制。我们观察到USP9X的表达没有明显上调,但Ku70的表达在所有的奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞中显著上调。然而,与亲代细胞相比,奥希替尼(osimertinib)并没有减少奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞中的Ku70。免疫荧光染色也显示了同样的现象。Ku70pcDNA3.1-Ku70-induced超表达的细胞中冲强劲延长mcl1水平和抑制奥希替尼(osimertinib)-induced细胞凋亡。然而,沉默的Ku70Ku70siRNAmcl1水平减少和增强中冲/或细胞的敏感性奥希替尼(osimertinib)。这些结果表明Ku70-mediatedmcl1upregulation参与收购阻力在EGFR-mutant奥希替尼(osimertinib)NSCLC细胞。

  蟾毒灵通过抑制Ku70下调对奥希替尼(osimertinib)耐受药物的NSCLC细胞中mcl1的表达

  接下来,我们研究蟾毒灵是否通过抑制ku70介导的MCL-1过表达来恢复奥希替尼(osimertinib)耐受药物细胞对奥希替尼(osimertinib)的敏感性。随着Ku70水平的减少,蟾毒灵医治后,mcl1的表达也随之减少。蟾毒灵和奥希替尼(osimertinib)联合显著减少了HCC827/OR和PC-9/OR细胞中Ku70和mcl1的表达。免疫荧光染色也观察到类似的结果。为了研究蟾毒灵是否通过抑制Ku70下调mcl1,我们在PC-9/OR细胞中诱导了Ku70的异位表达,然后用蟾毒灵处置。过表达Ku70显著挽救蟾毒灵诱导的细胞凋亡和抑制mcl1的表达。此外,免疫沉淀实验显示蟾毒灵减少了Ku70与mcl1的结合水平。此外,与单独使用两种药品相比,联用显著下调了NSCLC异种移植组织中mcl1和Ku70的表达。因此,我们证明蟾毒灵通过抑制ku70介导的MCL-1过表达,克服了对奥希替尼(osimertinib)的获得性耐受药物。奥希替尼(osimertinib)好多钱一瓶?一瓶能够服用多久?详情请扫码咨询:

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奥希替尼(osimertinib)的安全特性分析 奥希替尼

奥希替尼(osimertinib)的安全特性分析

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